动植物组织mRNA 提取试剂和方法步骤

动物植物组织mRNA 提取试剂和方法步骤

一、实验材料  水稻叶片或小鼠肝组织。 

二、实验室仪器：  研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

三、实验试剂
  1 、无  RNA  酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（ 180 ℃  2  小时）装蒸馏水，然后加入  0.01% 的 DEPC （体积 / 体积），处理过夜后高压灭菌。 

2 、75% 乙醇：用  DEPC  处理水配制  75% 乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻  璃瓶中，存放于低温冰箱。

3、 1 ×层析柱加样缓冲液； 20mmol/L Tris · Cl(pH7.6) ， 0.5mol/L NaCl ， 1mmol/L EDTA(pH8.0) ， 0.1% SDS 。

4、洗脱缓冲液： 10mmol/L Tris · Cl (pH7.6) ， 0.05% SDS 。  

  四、动植物总 RNA 提取操作步骤 

（一）动植物总  RNA 提取 -Trizol  法  Trizol  法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用  Trizol 法提取的总 RNA 无蛋白和 DNA  污染。 RNA 可直接用于  Northern  斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+  分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。

1、将组织在液  N  中磨成粉末后，再以  50-100mg  组织加入  1ml Trizol  液研磨，注意样品总体积  不能超过所用 Trizol  体积的  10%。

2、研磨液室温放置  5 分钟，然后以每  1mlTrizol  液加入  0.2ml  的比例加入氯仿，盖紧离心管，用  手剧烈摇荡离心管 15  秒。 

3 、取上层水相于一新的离心管，按每 mlTrizol  液加 0.5ml  异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置  10  分钟， 12000g  离心  10  分钟。

4、弃去上清液，按每  ml Trizol  液加入至少  1ml  的比例加入  75% 乙醇，涡旋混匀， 4 ℃下  7500g  离心  5  分钟。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥  5-10  分钟，注意不要干燥过分，否则会降低  RNA 的  溶解度。然后将  RNA  溶于水中，必要时可  55 ℃ -60 ℃水溶  10  分钟。 RNA  可进行  mRNA  分离，或贮 存于 70%乙醇并保存于-70℃。

[注意 ]

 1、整个操作要戴口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

2、加氯仿前的匀浆液可在 -70 ℃保存一个月以上， RNA  沉淀在  70% 乙醇中可在  4 ℃保存一周， -20  ℃保存一年。 

（二） mRNA 提取  由于  mRNA  末端含有多  poly(A)+ ，当总  RNA  流径  oligo(dT) 纤维素时，在高盐缓冲液作用下，  mRNA 被特异的吸附在  oligo(dT) 纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中， mRNA 可被洗下，经过两次 oligo(dT)  纤维素柱，可得到较纯的  mRNA 。

  1、用  0.1mol/L NaOH  悬浮  0.5-1.0g oligo(dT) 纤维素。 

2 、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经 DEPC  处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯 德吸管中，柱床体积为  0.5-1.0ml，用  3  倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。

3、用  1x  柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的  pH 值小于  8.0 。 

4 、将（一）中提取的 RNA  液于 65 ℃温育  5  分钟后迅速冷却至室温，加入等体积  2x  柱层析缓冲  液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有  RNA 溶液进入柱床后，加入  1 倍柱床体积的  1x  层析 柱加样溶液。 

5 、测定每一管的 OD260 ，当洗出液中  OD  为  0  时，加入  2-3  倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以 1/3  至 1/2  柱床体积分管收集洗脱液。

6、测定  OD260 ，合并含有  RNA  的洗脱组分。

7、加入  1/10  体积的  3M NaAc(pH5.2) ，  2.5  倍体积的冰冷乙醇， 混匀，  -20 ℃ 30  分钟。

8、 4 ℃下  12000g  离心  15  分钟，小心弃去上清液，用  70% 乙醇洗 涤沉淀， 4 ℃下  12000g  离心  5  分钟。

9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥  10 分钟，或真空干燥  10  分钟。

10、用少量水溶解  RNA  液，即可用于  cDNA  合成（或保存在  70% 乙醇中并贮存于 -70 ℃）。

当然，如果使用天根或碧云天的动植物组织 mRNA 提取试剂盒也会省去很多步骤，节约实验耗材成本。

[注意 ]

‍ 1、 mRNA 在  70% 乙醇中 -70 ℃可保存一年以上。

2、 oligo(dT) 纤维素柱用后可用  0.3mol/l NaOH  洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入  0.02% 叠氮钠（ NaN3) 冰箱保存，重复使用。每次用前需用 NaOH  水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。