蛋白纯化亲和层析原理

下图中圆球表示载体,球上黑色箭头表示配基。当各种不同功能的高分子物质(分别以方块、半圆和三角缺口来表示配基结合部位)通过时,只有带三角缺口的高分于物质能与固相上的配基专一结合，其它高分子物质则不受阻碍地流出，然后改变洗脱条件使分离目的物解离而洗脱下来。

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2，蛋白纯化亲和层析载体简介

三，亲和吸附和洗脱

   纯化蛋白质的亲和层析基本用柱法。在上柱时应选择配基和目的物之间作用的离子强度和pH组成,使最有利于形成亲和络合物，一般则选取中性pH作为吸附条件。样品应溶于亲和层析柱的平衡缓冲液中,或用平衡缓冲液进行透析。上柱速度尽可能慢，对温度不敏感的物质，室温纯化即可；对温度敏感的物质，可以采用在4℃下纯化，通常的亲和层析图谱如下图。

     样品上柱后分离目的物先紧密地吸附在亲和柱上,用平衡缓冲液洗涤时层析谱上出现第一个杂蛋白的峰。继续用大量平衡缓冲液充分洗涤，必要时用不同缓冲液洗涤以除去非专一吸附的杂质,使柱上只留下专一吸附的目的物。然后改变缓冲液，要求选择能减弱纯化目的物与亲和吸附剂之间吸附力的条件,使络合物解离洗出，图谱上出现第二个峰。一般洗脱方法是改变缓冲液的pH，改变离子强度或同时改变两者。洗脱蛋白质大多数用0.1mol/L稀醋酸或0.01mol/L稀盐酸，如果目的物会被酸破坏，可使用0.1mol/L氢氧化铵洗脱。蛋白质洗出后应立刻中和、稀释透析、重折叠为天然结构恢复蛋白质活性。

      除改变缓冲液pH作为洗脱方法以外，尚有用可溶性配基作竞争性洗脱。例如用较高浓度的抑制剂、辅酶或底物,竞争洗脱酶。用各种糖或低聚糖苷从固定化的植物凝集素亲和吸附系统上洗脱专一吸附的糖蛋白目的物。用这类洗脱剂的优点还在于它又一次地利用了生物专一性。但这种洗脱方法所得蛋白质溶液往往较稀，并含有可溶性洗脱剂，这可以用透析和凝胶过滤法除去。有些抗原和抗体结合力特别强，上述方法有时尚不能洗脱则可试用盐酸胍、尿素等蛋白促溶剂作为洗脱剂，洗脱的蛋白在适当处理后能恢复活力者才适用。当分离目的物洗脱下来后可连续使用大量洗脱液洗涤亲和柱，再用平衡缓冲液使亲和柱充分平衡，经过这样处理，亲和柱就可以重复使用。

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