细胞培养过程中细胞质控方案

更新时间：2023-04-07

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正如人有喜怒哀乐，细胞也是如此，细胞的活力和状态是不断变化的，而非一成不变的。在细胞体外培养的过程中，离开机体保护的细胞是很脆弱的，在陌生的生长环境下即便是培养条件的轻微改变，也可能对细胞产生无法预估的影响。在原代细胞培养过程中，即使保持培养条件一致，在传代过程中，细胞的存活质量也是逐渐下降的。

以人脐静脉内皮细胞（HUVEC细胞）为例，HUVEC细胞是研究内皮细胞功能的经典体外细胞模型。在心血管疾病的研究中，主要用于研究内皮细胞功能改变或损伤后其衍生细胞因子对血压的影响；在肿瘤研究中，主要用于实体瘤中血管生成的研究。然而，HUVEC在传代培养过程中，其活力是逐渐衰退的，因此细胞传代最多不超过10代。

新鲜的HUVEC

衰老的HUVEC

传统的细胞培养主要是通过显微镜下形态学变化以及传代培养周期的变化预估细胞生长生存状态。这种主观判断既无法量化，也无法进行统计学分析。因此，目前对细胞存活质量的判断并没有准确、客观的统一标准，并且对体外培养细胞的存活质量控制往往被科研工作者们“忽略"，从而导致实验结果的不稳定。

体外细胞的有效培养新概念——“细胞质控"。通过细胞活力、细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖及DNA损伤五方面对细胞生长生存状态进行监控。

在这五个方面中，影响最大的便是细胞活力，下面咱们专门来谈一谈细胞活力如何判断。在体外细胞培养的过程中，细胞总有一些因各种原因而死亡，总细胞中活细胞所占的百分比，即是我们常说的细胞活力。“细胞质控"中最基础的指标便是细胞活力。常见的流式细胞设备及部分细胞计数仪器都可以对细胞进行绝对计数，还可以提供准确、客观的细胞活力数据，为“细胞质控"提供准确、客观的统计学依据，细胞活力评估并不困难！

满足以下两个条件就可以进行细胞活力检测

1. 正常细胞的细胞膜是完整的。

Propidium iodide（PI碘化丙啶）是一种核酸染料，常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测和流式细胞仪分析。PI不能通过正常完整的细胞膜，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色，可以用来分辨坏死细胞/正常细胞。

2. 加入另一种可以透过细胞膜的核酸染料，就可以通过两种染料将活细胞和死细胞区分开。

PI经常被用来与Calcein-AM或者FDA等荧光探针一起使用，能同时对活细胞和死细胞染色。PI-DNA复合物的激发和发射波长分别为535 nm和615 nm。

细胞活力的技术标准界定

应用案例：纳米药物毒性测试

纳米药物的研究是近年来新药研发的热点。纳米药物载体筛选的首要标准是检测其对细胞的毒性。而在细胞毒性测试中，首先要排除的是基底培养过程中产生的死细胞，即“噪音信号"。在对新型纳米药物载体SEONLA的研究中，Zaloga等人认为只有活细胞比例超过90%方可进行细胞毒性研究，细胞质控的重要性由此可见一斑。

细胞毒性的入门级指标是细胞活力。判断一种物质（化合物、小分子药物或蛋白质等）对细胞的毒性首先要观察的是其是否或诱导细胞死亡，即细胞活力的变化。以维生素C为例，研究发现，高浓度维生素C对眼癌细胞Y79 Retinoblastoma Cells具有杀伤作用。文章中，作者以眼癌常用化疗药Melphalan作为对照，对经过处理的细胞活性进行检测，发现，随着浓度的升高，维生素C对Y79 Retinoblastoma Cells杀伤作用逐渐增强，并且维生素C对眼癌细胞的杀伤作用优于Melphalan。这一实验结果为眼癌更安全、更有效的治疗方案的提出提供了理论依据。

细胞质控仪测得数据

除了细胞毒性研究，细胞质控在病毒感染或者RNA转染的研究中也是非常重要的。在这一类研究中，转染/感染试剂或多或少都会对细胞有一定杀伤作用。因此，在转染之前，活细胞需要达到一定的比例才可以保证在转染之后有足够数量的细胞进行后续的研究。而这一比例需要实验条件摸索才能确定。

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